摘要目的：优化管花肉苁蓉中毛蕊花糖苷的提取工艺，为该药材的深入开发和综合利用提供参考。方法：采用高效液相色谱法对管花肉苁蓉中的毛蕊花糖苷进行含量测定。色谱柱为Inertsil-ODS-3V，流动相为甲醇-0.2％甲酸水溶液（40 ∶ 60，V/V），流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为330 nm，进样量为10 μL。以毛蕊花糖苷的提取率为考察指标，分别对浸泡时间、乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数进行单因素试验；根据上述试验结果采用Box-Behnken 响应面法对乙醇浓度、液料比、提取时间等条件进行优化，并对优化后的提取工艺进行验证试验。结果：毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65～932.4 μg/mL。最优提取工艺为乙醇浓度63％、液料比8 ∶ 1（mL/g）、浸泡2 h、提取时间1.5 h、提取2 次。3 次平行验证试验所得毛蕊花糖苷的提取率分别为78.21％、76.95％、79.34％，与预测值76.76％的相对误差分别为1.89％、0.25％、3.36％。结论：优化所得管花肉苁蓉中毛蕊花糖苷的提取工艺稳定、可行，适用于该化合物的提取。

关键词：管花肉苁蓉；毛蕊花糖苷；响应面法；Box-Behnken 设计；提取工艺；优化

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管花肉苁蓉为列当科植物管花肉苁蓉[Cistanche tubulosa（Schenk）R. Wight]的干燥带鳞叶的肉质茎，性温、味甘咸，为补肾壮阳、润肠通便之要药，是中亚地区及新疆特有的药用植物，主要分布于南疆塔克拉玛干沙漠边缘地区[1]。管花肉苁蓉收载于 2015 年版《中国药典》（一部）[2]，其主要功能成分为苯乙醇苷类化合物[3]。近年来研究发现，管花肉苁蓉中的苯乙醇苷类化合物在神经保护[4]和延缓神经退行性疾病[4-5]方面具有良好的开发前景，现已成为研究的热点之一。毛蕊花糖苷为苯乙醇苷类化合物中的活性成分之一，本课题组前期药效评价实验结果表明，毛蕊花糖苷对神经细胞具有保护作用[4]、对东莨菪碱所致小鼠学习记忆获得性障碍具有改善作用[5]、对 D-半乳糖致衰老模型小鼠的氧化损伤具有抑制作用[6]。毛蕊花糖苷在管花肉苁蓉中的含量约为 0.05～8％[7]，对其进行开发利用具有很大的药用前景。药效学实验表明，毛蕊花糖苷具有多靶点作用，有望开发成保护脑神经、改善记忆的脑病药物[8-9]。

Box-Behnken响应面设计法是可靠的实验设计以及分析方法，可通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制来计算出响应于各因素水平的响应值，是解决多变量问题的一种有效的统计方法[10]。鉴于此，本研究采用该法优化管花肉苁蓉中毛蕊花糖苷的提取工艺，为管花肉苁蓉的深入开发和综合利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪，包括LC-20AB型二元泵、SPD-M20A型二极管阵列检测器、CBM-20A型系统控制器、CTO-20A型柱温箱、SIL-20A型自动进样器（日本Shimadzu公司）；SQP-QUINTIX 35-1 CN型万分之一分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；DZTW型恒温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

管花肉苁蓉炮制片（新疆维吾尔自治区和田苁蓉堂2015 年秋收炮制片，批号：20150806，毛蕊花糖苷含量：≥3.79％；将管花肉苁蓉炮制片用药锤敲碎，粉碎机粉碎后过四号筛，即得管花肉苁蓉粉末，备用）；毛蕊花糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111530-201208，纯度：92.5％）；甲醇为色谱纯，甲酸、乙醇等为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 毛蕊花糖苷的含量测定

采用高效液相色谱法（HPLC）测定。 2.1.1 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-3V（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2％甲酸水溶液（40 ∶ 60， V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：330 nm；进样量 10 μ L。在上述色谱条件下，取“2.1.2”“2.1.3” “2.1.4”项下溶液进样测定，色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，得每1 mL含毛蕊花糖苷0.932 4 mg的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

准确称取管花肉苁蓉粉末100 g，按液料比8 ∶ 1（溶剂体积 ∶ 粉末质量，mL/g，下同）加入63％乙醇，浸泡2 h，然后置于100 ℃恒温水浴锅中回流提取2次，每次1.5 h，趁热滤过，放冷，合并提取液，精密量取提取液 1 mL 至 25 mL 量瓶中，加 50％甲醇定容，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

分别以 50％甲醇与 63％乙醇作为阴性对照溶液。

2.1.5 方法学考察

精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.2、0.5、1、2、3、5、10 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1.1”项下色谱条件测定。以对照品溶液质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝19 952x－218 412（r＝0.999 8），表明毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为 18.65～932.4 μg/mL。以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1测得定量限、检测限分别为0.229 6、 0.071 8 μg/mL。方法学考察结果显示，精密度[毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.57％（n＝6）]、稳定性[毛蕊花糖苷峰面积的RSD为1.38％（n＝6）]、重复性[毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.87％（n＝6）]、加样回收率[毛蕊花糖苷低、中、高质量浓度的平均加样回收率依次为 99.6％、100.5％、100.7％，RSD 分别为 2.55％、0.83％、0.44％（n＝9）]均符合2015年版《中国药典》（四部）要求[11]。

2.2 提取方法

准确称取管花肉苁蓉粉末，按一定液料比加入适宜浓度的乙醇，浸泡一定时间后，置于 100 ℃恒温水浴锅中回流提取数次，趁热滤过，放冷，合并提取液，精密移取提取液 1 mL至 25 mL 量瓶中，以 50％甲醇定容后，取样 10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，按标准曲线法计算毛蕊花糖苷含量。另取管花肉苁蓉粉末，采用2015年版《中国药典》（一部）项下方法[2]进行含量测定，并通过以下公式计算毛蕊花糖苷提取率[12]：提取率（％）＝{[提取液体积（mL）×提取液含量（mg/mL）]/[药材质量（g）×药材含量（mg/g）]}×100％。 2.3 单因素试验在管花肉苁蓉苯乙醇苷类成分乙醇回流提取的过程中，浸泡时间、乙醇浓度、提取时间、液料比、提取次数等因素对提取效果有重要影响[13-14]。因此本研究以毛蕊花糖苷提取率为考察指标，对上述因素进行考察。 2.3.1 浸泡时间称取管花肉苁蓉粉末100 g，共5份，固定提取时间为1 h、液料比为10 ∶ 1、溶剂浓度为60％、提取次数为1次，分别对浸泡时间0、2、8、12、24 h进行考察，结果见图2A。由图2A可见，当浸泡时间≥2 h，毛蕊花糖苷的提取率基本趋于稳定，综合考虑提取效率，最终确定最佳浸泡时间为2 h。 2.3.2 乙醇浓度称取管花肉苁蓉粉末100 g，共4份，