摘要:目的研究类叶升麻苷在M PTP诱导的C57小鼠的帕金森病(PD)模型中的神经保护作用及机制。方法通过自主活动实验和滚筒实验研究动物的行为表现,通过高效液相电化学检测方法观察脑纹状体多巴胺的变化,通过脑黑质酪氨酸羟化酶(ty roxine hydroxy lase,TH)免疫组化染色观察多巴胺能神经元的损伤程度。并对黑质纹状体进行α-突触核蛋白(α-synuclein)的免疫印迹分析以探讨药物作用机制。结果①经M PTP诱导的C57小鼠,其自主活动次数、滚筒运动潜伏期均低于对照组(P<0.01);纹状体多巴胺含量明显降低(P<0.01);多巴胺能神经元数量明显减少;黑质纹状体α-synuc le in蛋白水平下降。②经类叶升麻苷(10、30 m gkg-1)预处理后能明显改善M PTP诱导的C57小鼠的行为学表现,增加脑内多巴胺递质的含量,增加多巴胺能神经元的数量,增加黑质纹状体α-synuclein蛋白水平。结论类叶升麻苷具有神经保护作用,能对抗M PTP诱导的C57小鼠PD模型中的神经损伤。其机制可能与上调α-synucle in蛋白水平有关。

关键词:类叶升麻苷;M PTP;PD模型;酪氨酸羟化酶;α-突触核蛋白;神经保护

帕金森病(P ark insons d isease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元的变性和坏死,导致神经递质多巴胺的不足,最终造成PD特有的运动功能障碍。由于PD的病因复杂,社会危害大,随着高龄化社会的到来,寻找具有抗PD功效的天然药物尤为重要。

肉苁蓉(Herba Cistanches)为常用的传统补益中药,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。其有效成分为苯乙醇苷类化合物(pheny le thanoid glyco-sides,PhG s)。本实验室前期研究工作发现苯乙醇总苷具有对抗MPTP损伤C57小鼠多巴胺能神经元保护作用[1]。其总苷成分之一类叶升麻苷(ac te-oside)在其中的含量达10,在细胞水平上抗PD细胞凋亡的作用亦得到证实[2,3],而其在整体动物水平的抗PD作用及对家族性PD致病相关蛋白α-sy-nuclein的调节作用尚未见报道。α-synuc lein也叫α-突触核蛋白,是近年来在PD发病研究机制中得到广泛关注的蛋白,它与遗传性PD和散发性PD都有密切关系,已有的研究表明:α-synucle in可能是PD发病的中心环节。观察在MPTP损伤和药物干预的情况下该蛋白的变化情况,将有助于揭示PD的发病机制和具有保护作用的药物的作用机制。因此本实验进一步研究类叶升麻苷的神经保护作用及其可能的机制。为开发具有抗PD作用的天然药物提供初步实验依据。

1材料与方法

1.1动物C57BL/6小鼠,♂,体重20～25 g,由北京大学医学部实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK 11-00-0004。

1.2药品类叶升麻苷由北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授提供,相对分子量624,易溶于水,纯度达到98以上。

1.3试剂1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP),为S igm a公司产品。α-synucle in蛋白单克隆抗体由北京宣武医院于顺教授提供,酪氨酸羟化酶(ty rox ine hydroxy lase,TH)多克隆抗体为美国Chem icon In te rnational公司产品,H istostain-SP K its为北京中山生物技术有限公司产品,ECL试剂为北京普利莱生物技术公司产品。

1.4仪器XZ-4型小鼠自主活动仪,由中国医学科学院药物研究所研制。SD-2型小鼠滚筒仪,北京大学医学部实验仪器厂生产。ESA库仑电化学检测器5600A,美国Princeton Applied Research C orpora-tion生产,C18柱,迪马公司产品。

1.5动物模型的建立及分组给药60只小鼠随机

分5组,每组12只,分别为对照组、模型组、阳性药金刚烷胺组(40 m g kg-1)、以及类叶升麻苷给药组(10,30 m g kg-1)。连续灌胃给药14 d,于第11天开始灌胃给药前1 h腹腔注射M PTP 30 m g kg-1(对照组给予等体积的生理盐水),连续4 d,最后1次给药后1 d,进行行为学指标测试,4 d后脱颈处死,分别取小鼠脑纹状体和黑质,于-80℃保存,用于分别测定多巴胺含量以及免疫组化和W estern blot分析。

1.6指标测定及方法

1.6.1一般行为学观察观察小鼠在腹腔给予M PTP造模后的一般行为表现,有无异常反应,比较分析各组之间的差异。

1.6.2自主活动实验使用XZ-4型小鼠自主活动仪测定小鼠自发活动并记数,将小鼠放入自主活动箱中(高:13 cm,直径:25 cm,每次同时测定4只小鼠,每个活动箱中1只)由记录仪自动记录小鼠活动,测定每只小鼠5 m in内的活动次数[6],进行统计学处理。

1.6.3滚筒实验使用SD-2型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚筒行为表现[7]。测试前连续训练3 d,每天2次,转速为12 r m in-1,训练时间120 s。将小鼠置于滚筒仪的滚筒上,设置转速35 r m in-1,测试小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期,测试时间为120 s。每只小鼠测3次取平均值。

1.6.4高效液相-电化学法(H PLC-EC)分析采用H PLC-EC测定纹状体内DA的含量。样品预处理:将小鼠脱颈处死,取小鼠双侧纹状体置于冰浴上,加入100μl溶液A(0.4 m o l L-1 HC lO)冰浴超声匀浆处理,4℃静置1 h,注意避光保存。然后离心15 m in(15 000×g,4℃),取上清加入40μl溶液B(20 mm ol L柠檬酸钠,300 mm o l L K 2H PO 4和2 mm ol L-1 Na EDTA),充分混匀后4℃静置1 h,条件同上。再离心15 m in(15 000×g,4℃),得到样品上清,-80℃存放备用。

样品测定条件:施加电势:0～500 mV,以100

mV递增。流动相:柠檬酸缓冲液100 mm ol L,

Na2 EDTA 100 mm ol L,八烷基硫酸钠20 mmo l L,20甲醇。样品预处理液:0.4 m o l L HC Ol 4,200 mm o l L柠檬酸甲缓冲液。C18柱流速:1 m l m in-1,温度24℃±1℃。进样量:10～20μl。多巴胺含量用μg g-1湿组织重表示。

1.6.5免疫组化分析将小鼠用戊巴比妥钠(50 m g kg,ip)麻醉后,先用生理盐水灌注,再用4的多聚甲醛缓冲液灌注,取出脑组织置于4多聚甲醛缓冲液内,室温存放。对黑质进行石蜡切片(厚10μm),做TH的免疫组化染色。使用TH多克隆抗体以及H istostainTM-SP K its试剂盒。DAB显色观察细胞的阳性反应。显微照相的放大倍数为33倍。

1.6.6 W estern blo t实验样品预处理:将小鼠断头处死,在冰浴的培养皿上迅速分离黑质和纹状体,置于Eppendo rf管内迅速称重,于-80℃冰箱存放。加入匀浆缓冲液(1 g:5 m l)冰浴制备匀浆,匀浆缓冲液为80 mm o l L-1 Tris-HC l缓冲液(pH 7.4),0.1 mm o l L PM SF,0.4 mm o l L DTT,0.1 SD S(W/V),2 mm o l L Na2 EDTA。将匀浆液离心15 m in(15 000×g,4℃),收集上清,并使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,以保证各电泳各上样总蛋白浓度一致。得到的蛋白提取液经12.5 SDS-PAGE变性凝胶电泳后,以250 mA恒流1 h进行电转移,用5脱脂奶粉封闭1 h。加入α-synuclein的单克隆抗体(1∶1000稀释),4℃孵育过夜。之后,加入辣根酶标记二抗37℃孵育1 h。ECL发光液曝光,X光片显影、定影。

1.6.7统计学处理所有数据均以–x±s表示。除滚筒实验采用M ann-W hitney U检验外,其余实验的各组间比较采用单因素ANOVA检验。

2结果

2.1一般行为学腹腔给予M PTP(30 mg kg-1)后5 m in开始,与对照组相比M PTP模型组小鼠的一般行为表现异常,大多数出现下列变化:举尾、竖毛、唾液分泌增多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感以及牙颤等,其持续时间一般为2～3 h。而类叶升麻苷(10、30 mg kg-1)和金刚烷胺(40 m g kg)组,其症状表现较轻,持续时间较短。

类叶升麻苷对MPTP所致帕金森病小鼠模型的神经保护作用_赵磊_02.png