毛蕊花苷对MP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

毛蕊花苷对MP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

邓敏1,鞠晓东2,樊东升1,屠鹏飞3,张俊1,沈扬1

(北京大学1.第三医院神经科、2.第三医院运动医学研究所、3.中药现代化研究中心,北京100083)

中国图书分类号:R 284.1;R 329.2;R 329.25;R 341;R 345.79;R 745.702.2;R745.705.31;R 977.3 文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)10-1297-06

摘要:目的观察肉苁蓉提取物毛蕊花苷对MP+诱导的SHSY5Y细胞损伤的影响。方法用MT法检测细胞存活率,以流式细胞仪检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,以及细胞凋亡的发生,并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性,蛋白印迹测定Bcl-2的表达水平。结果200μmol·L-1 MP+处理细胞24 h降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达38.9;细胞内活性氧水平及caspase-3的活性升高;而线粒体膜电位却明显降低。而预先给予0.1、1或者10 mg·L-1浓度的毛蕊花苷处理细胞12 h,可提高细胞存活率;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到29.5,15.3和8.6,而且细胞内活性氧的水平明显降低,并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;caspase-3的活性不断降低,Bcl-2的表达水平增高,并呈现一定的剂量依赖性。结论毛蕊花苷能抑制MP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平,维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。

关键词:毛蕊花苷;细胞凋亡;过氧化氢;SHSY5Y细胞;线粒体膜电位;活性氧;半胱氨酸蛋白酶3

帕金森病(Parkinsonsdisease,PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病,主要是由于黑质多巴胺能神经元坏死、凋亡,使黑质—纹状体通路多巴胺释放减少,造成多巴胺—乙酰胆碱失衡。人们早已证实神经元凋亡是帕金森病神经细胞死亡的主要[1]机制而且病灶周围都要产生大量的活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)。近来研究发现,细胞内ROS累积、线粒体膜电位(MMP)下降是氧化应激诱导细胞凋亡、引起细胞损伤的关键因素,因此可以把减轻氧化应激作为药物作用的靶点之一,用于神经保护药物的筛选。

肉苁蓉(HerbaCistanches)为肉苁蓉属植物干燥带鳞叶的肉质茎,具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效,有“沙漠人参”之美誉[3,4]。一系列研究表明肉苁蓉可以提高多种中枢神经递质的含量,具有很强的抗氧化作用,还可延长动物寿命和抗衰老作用,而苯乙醇苷类化合物被认为是肉苁蓉的主要活性成分[5,6]。毛蕊花苷(verbascoside)是从管花肉苁蓉(Cistanchetubulosa)中分离、纯化的一种苯乙醇苷类化合物(Fig1)。本文以SHSY5Y细胞为研究对象,用1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-pheny-lpyridinium,MP+)诱导建立PD的体外细胞损伤模型,观察毛蕊花苷对SHSY5Y细胞的保护作用及其可能机制。

肉苁蓉的有效成分：毛蕊花糖苷

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂MP+、胰蛋白酶(trypsin)、4-甲基偶氮唑蓝(MT)为Sigma公司产品;MEM培养基和胎牛血清为Gibco公司产品;荧光标记的钙结合蛋白(AnexinV-FITC)和碘化丙啶(propidum iodide,PI)为BoehringerManheim产品;检测细胞内自由基的荧光探针2′7′-二氯荧光素乙酰乙酸盐(2,7-dichlo-rodihydrofluoresceindiacetate,H2 DCFDA)和线粒体膜电位的RH123为MolecularProbes公司产品;Caspase-3检测试剂盒为Promega公司产品;毛蕊花苷由北京大学药学院屠鹏飞教授提取,易溶于水,经HPLC检测纯度>98。

1.1.2细胞株SHSY5Y细胞(人神经母细胞瘤株)由首都医科大学宣武医院北京脑老化重点实验室惠赠。

1.1.3主要仪器2487双波长紫外-可见分光光度检测器;倒置荧光相差显微镜:德国LEICA公司;CO2孵箱;SANYO公司图像分析系统:SPOT22ColedC D;配置Metamorph图像分析软件;德国LEICA公司;流式细胞仪:美国BD公司;多功能读板机:美国WalacVictorTM公司。

1.2方法

1.2.1SHSY5Y细胞的培养与药物处理用含

10(体积分数)胎牛血清的MEM培养液培养细胞,每2～3 d换液1次。待细胞增长至80融合时,用0.25胰酶消化细胞,加含血清培养基终止反应。用滴管吹打使其成为单细胞悬液,1∶3分瓶传代。细胞先经200μmol·L-1的MP+作用不同时间点,分别于24、48、72 h后用倒置显微镜和MT法观察细胞存活情况,发现48 h和72 h组的细胞绝大部分死亡,而24 h组的细胞存活率适于进行药物干预实验,故均采用MP+作用24 h后进行如下实验。毛蕊花苷(0.1、1、10 mg·L-1)预处理SHSY5Y细胞12 h后,加200μmol·L的MP,24 h后收获细胞。凋亡诱导组只加入200μg·L-1的MP+,正常对照组加入等体积PBS。

1.2.2MT法检测细胞活性以1×104浓度接种

SHSY5Y细胞于96孔板中,24 h后进行实验。每孔加入含5 g·L-1的MT培养液,培养4 h后弃培养基,每孔加入DMSO200μl,充分震荡,待蓝色颗粒完全溶解后用全自动酶标仪测定570 nm处的吸光度值(A570 nm),用于定量反映细胞的存活率。

1.2.3细胞内活性氧定量检测细胞内活性氧的测定采用荧光探剂H2 DCFDA,该荧光探剂在乙酰乙酸盐的帮助下进入细胞内,在胞内水解、氧化、脱氢后形成荧光素发光,荧光发光强度和细胞内活性氧的水平成正比。因此该荧光探剂可定量检测细胞内活性氧。收集正常对照组、MP+组、毛蕊花苷组1×106细胞,悬浮于含10μmol·L-1的DCFH-DA荧光探剂的无血清DMEM,37℃,5 CO2孵箱内孵育20 min,用无血清DMEM洗3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用FACScan流式细胞仪测定DCF的平均荧光强度,激发光波长为488 nm,发射波长为525 nm,以各处理组/正常对照组的比值作为ROS的数值。

1.2.4细胞内线粒体膜电位测量罗丹明123

(Rh123)是一种亲脂性的阳离子荧光探针,可穿过活细胞的线粒体基质,由于线粒体膜间隙具有负电位,而Rh123具有正电位,电性相吸,因此可用Rh123标记线粒体。通过检测Rh123的荧光强度来反映细胞MMP。收集正常对照组、MP+组、毛蕊花苷组1×106细胞,加入终浓度10 mg·L-1的Rh123,37℃避光孵育1 h;PBS漂洗1 min×2次,以去除未结合的染料,用FACScan流式细胞仪测定其平均荧光强度(meanfluorecenceintensity,MFI)代表细胞MMP的状态。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡细胞凋亡用AnexinV-FITC试剂盒进行检测,方法按试剂盒说明书进行,简述如下:药物处理24 h后,收集1×106细胞,PBS洗2～3次,500 r·min-1离心5 min后重悬于200μl的缓冲液中,加入10μl的AnexinV-FITC和5μl的PI,轻轻混匀,避光室温反应15 min,再加入300μl缓冲液,立即上机检测。

1.2.6caspase-3活性测定采用Apo-ONETM Hom-ogeneouscaspase-3试剂盒测定caspase-3活性,方法按试剂盒说明书进行。简述如下:104细胞/孔接种于96孔板,不同药物处理细胞24 h后,冰PBS冲洗,每孔加入caspase-3反应液100μl震荡混匀,室温避光反应4 h后在多功能荧光读板仪测定Z-DEVD-R110的荧光强度,激发波长498 nm,发射波长为521 nm,单位以relativefluorescence units(RFU)表示。

1.2.7 Bcl-2蛋白印迹测定收集不同组的25 cm2

培养瓶内细胞,400μl细胞裂解液冰上裂解5 min,收集并离心,取上清,考马斯亮蓝G250蛋白定量;SDS-PAGE电泳,湿法转膜,5脱脂奶粉室温封闭2 h,分别加入1∶200稀释的Bcl-2多克隆Ⅰ抗4℃过夜;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗反应1 h;膜上加1 mlluminolA+luminolB的混合液,暗室反应1 min,X胶片爆光15 s,常规显影、定影,扫描,用HPIAS-1000图像分析软件进行蛋白表达的半定量分析,结果用吸光度值表示。

1.3数据处理和统计学检验所有结果以x±s表示,多组间比较采用完全随机设计方差分析(ANO-VA),两组间比较采用Student′st检验,应用SPS统计软件处理。

2结果

2.1毛蕊花苷明显拮抗MP+对SHSY5Y细胞的毒性作用MT检测发现MP+作用24 h后导致

SHSY5Y细胞的存活率下降为42.6,而毛蕊花苷预处理12 h后(0.1、1、10 mg·L-1)明显抑制MP+所造成的细胞死亡,并呈现一定的剂量依赖型,细胞死亡率分别为38.2、23.6和10.0(Fig2)。