【摘要】目的：探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对转化生长因子β1(TGF-β1)介导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化作用及对TGF-β1/Smad信号通路表达的影响。方法：试验分为正常对照组、5 ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度(25、50、75和100μg/mL)CPhGs给药组，另设只加DMEM培养液的空白组。体外培养HSC-T6细胞，通过四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞的增殖；LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性；采用荧光定量PCR(qPCR)检测Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；采用Western blot法检测Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖，而50~100μg/mL的CPhGs可以抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖(P<0.05)，且25~100μg/mL的CPhGs对HSC-T6无明显细胞毒性作用；25~100μg/mL CPhGs均可抑制Smad2和Smad3 mRNA和蛋白水平的表达，且明显抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化水平，促进Smad7 mRNA和蛋白的表达，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断TGF-β1/Smad通路进而阻断HSC-T6细胞的活化和增殖有关。

【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；转化生长因子β1；肝星状细胞；肝纤维化

中图分类号：R961.1文献标志码：A文章编号：1004-616X(2016)05-0372-05 doi:10.3969/j.issn.1004-616x.2016.05.008

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)的发生与慢性肝脏炎症及损伤等化学因素相关，它是肝脏在慢性或反复损伤后的一种损伤与修复过程[1-3]，是目前发病率和死亡率都很高的世界医学难题。肝星状细胞(hepaticstellate cells，HSC-T6)的活化是肝纤维化发生发展的关键环节[4-6]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)被公认是致肝纤维化最强有力的细胞因子之一，它参与细胞的生长、分化及凋亡，激活HSC-T6，刺激细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和沉积[7]，TGF-β1/Smad信号通路是肝纤维化研究的热点。肉苁蓉(cistanche)是著名的名贵补益类中药，其发挥药效的主要物质基础之一是苯乙醇总苷(phenylethanoid glycosides from cistanchetubulosa，CPhGs)[8]，研究显示CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种化学作用及药理作用[9-13]。前期研究显示，CPhGs能够防治牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)所致的大鼠免疫性肝纤维化[14]，并能显著降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1的水平，抑制肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1的表达，改善大鼠肝纤维化程度[15]。而CPhGs治疗肝纤维化的作用是否与TGF-β1所介导的TGF-β1/Smads信号转导通路有关？为深入探讨CPhGs治疗肝纤维化的作用机制，本研究以HSC-T6为靶细胞，采用体外给药从TGF-β1/Smad信号转导通路的角度来探讨CPhGs抗肝纤维化作用的分子生物学机制。

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1材料与方法

1.1试剂与仪器

管花肉苁蓉，取自新疆和田地区，物种标本凭证存放于新疆中药研究所。CPhGs由新疆维吾尔自治区药物研究所从管花肉苁蓉中提取纯化，纯度为70%；试验时用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养液溶解，经0.22μm滤器过滤后，配制成不同浓度。大鼠HSC-T6细胞系购自武汉Procell生物科技有限公司；TGF-β1购自Peprotech公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成生物有限公司；Smad2、Smad3、Smad7、β-actin引物由上海生工生物技术有限公司设计、合成；cDNA反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司；荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自QIAGEN GmbH公司；Smad2多克隆抗体和β-actin单克隆抗体购自武汉Protein Tech公司；Phospho-Smad2(ser465/467)抗体、Smad3(C67H9)抗体和Phospho-Smad3(ser423/425)抗体购自Cell Signaling Technology公司；Smad7抗体购自武汉Boster公司；碱性磷酸酶标记的二抗购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液购自美国Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自于美国Millipore公司。

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主要仪器有：倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；低温离心机(美国Sigma公司)；凝胶成像仪、Western blot电泳装置、转移装置(美国Bio-Rad公司)；图像分析仪Alpha Imager 2000、图像分析系统(Alpha Innoteeh公司)。

1.2HSC-T6细胞的培养和传代

HSC-T6细胞常规复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培养液，在37℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度下培养；当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h换液，72 h再传代；选用对数生长期细胞进行试验。

1.3MTT法检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞增殖的影响

取对数生长期的HSC-T6细胞，消化、离心，以5×104/mL接种于96孔板，每孔200μL，24 h后细胞完全贴壁展开，吸去培养液，再用含10%小牛血清的DMEM培养液同步化细胞。试验分为正常对照组、5 ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度(25、50、75和100μg/mL)CPhGs给药组，另设不加细胞只加DMEM培养液的空白组，每孔总体积200μL，每组设4个复孔，于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱分别培养48 h，MTT法于酶标仪测定吸光度D(490)值。

抑制率={[D(490)模型组-D(490)空白组]-[D(490)用药组-D(490)空白组]}/[D(490)模型组-D(490)空白组]×100%

1.4LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性

细胞分组处理同1.3，收集上清液。按乳酸脱氢酶LDH试剂盒说明书步骤进行测定。LDH(U/L)=[D(490)测定孔-D(490)对照孔]/[D(490)标准孔-D(490)空白孔]×0.2 mmol/L×1 000

1.5qPCR检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达的影响

细胞分组处理同1.3。CPhGs作用48 h后，收集细胞，总RNA用Trizol提取(按试剂盒说明书操作)，加0.2 mL氯仿抽提纯化，电泳检测完整性，分光光度法测定其含量及纯度，测定D(260)/D(280)值。cDNA合成参照逆转录试剂盒说明书合成，加入待测定指标的引物，引物利用软件Batch Primer 3设计，由上海生工生物公司合成。序列见表1。反应条件：94℃变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环30次，终末72℃延伸10 min。并以β-actin基因作为内参，以待测基因/β-actin的比值作为待测基因mRNA的相对表达量(2-ΔΔCT)。结果的计算和分析采用IQ5 Real Time PCR检测系统。

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3讨论

肝纤维化是慢性肝损伤后修复反应的动态过程，HSC-T6的活化和增殖是肝纤维化发生的基础，现已证实肝纤维化发生的关键环节是HSC-T6的激活及其激活后过多的细胞外基质在肝脏沉积所致。HSC-T6的活化是静止的HSC-T6向肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)转化的过程，HSC-T6在肝损伤因子的作用下，由静止的富含VitA的正常形态向MFB转化，表现为细胞增殖、趋化性、纤维产生、收缩性、VitA的丢失等，以细胞增殖及胶原合成明显增强为主要特征。而TGF-β1是目前公认最重要的致肝纤维化因素之一，以自分泌和旁分泌两种形式促进HSC-T6活化[16]。因此，本研究中，探索使用TGF-β1刺激HSC-T6，建立TGF-β1诱导HSC-T6活化的细胞模型。结果显示，TGF-β1+CPhGs 50~100μg/mL剂量组均不同程度地抑制TGF-β1诱导的HSC-T6的增殖，提示抑制HSC-T6增殖可能是CPhGs抗肝纤维化的作用机制之一。

目前最常用的细胞毒性试验是基于细胞膜通透性的改变、细胞内成分释放入上清液的原理，通过检测上清液中某些成分的含量，辨别细胞膜通透性的变化。LDH是活细胞胞浆内酶，正常情况下不能透过细胞膜，当细胞受损时，细胞膜通透性增高，LDH释放至细胞外[17]。本文中，通过测定上清液中LDH的水平可以反映细胞损伤程度。我们发现不同浓度的CPhGs作用HSC-T6细胞48 h后上清液中LDH水平与空白对照组比较差异不明显，提示，CPhGs在有效抑制HSC-T6增殖的同时，对HSC-T6基本上无毒性。

TGF-β1介导的TGF-β1/Smad信号转导在HSC-T6细胞外基质表达调节中的作用是研究肝纤维化的热点课题。Smads是TGF-β胞内最重要的信号通路，不同类型的Smads分子作用各异，Smad2和Smad3可传递促肝纤维化信号，而Smad7可传递抗肝纤维化信号。Smad2和Smad3过度表达及Smad7被抑制是TGF-β1/Smad

通路持续激活，导致细胞外基质大量堆积的原因。因此，通过靶向性阻断Smad2和Smad3信号蛋白，加强Smad7信号蛋白表达有望成为肝纤维化治疗的新途径。结果显示，HSC-T6在TGF-β1刺激下大量活化增殖，Smad2、Smad3 mRNA表达增加，Smad7 mRNA表达下降，这与CPhGs抑制BSA诱导的肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1的表达和胶原产生(免疫组化)结果一致[18]。作为抑制型Smad，Smad7在结构上和Smad2与Smad3有很大不同，因蛋白的序列只有DNA连接的MHl和MH2区，而缺失了C端的SSXS基序，SSXS基序是磷酸化的靶区，故监测不到磷酸化水平，但其作用和功能在各种疾病中也备受关注，Smad7蛋白与活化的I型受体相结合后，可以阻止Smads与Smad4蛋白形成杂聚体并进行细胞核内转移，通过提高Smad7蛋白的表达来抑制TGF-β1/Smad信号在转导通路中的传递，可为防治相关的疾病提供一种全新的思路和治疗方法[19]。实验结果显示，CPhGs作用于TGF-β1刺激的HSC-T6细胞株后，Smad2、Smad3蛋白及其磷酸化水平的表达均降低，Smad7蛋白表达升高，提示CPhGs对TGF-β1/Smad信号通路的影响除了可以作用于转录水平，同时从蛋白水平同样可以抑制Smad2、Smad3蛋白的表达、磷酸化与核转位；升高抑制型Smad7蛋白的表达，也能干扰TGF-β1在细胞内的信号转导，从而减少细胞外基质的生成。提示，CPhGs可能通过阻断TGF-β1/Smad信号通路中Smad2、Smad3的表达及增加Smad7的表达，或者通过与Smad2、Smad3、Smad7相互作用抑制TGF-β1的效应而起到治疗肝纤维化的作用。

综上所述，CPhGs对肝纤维化的防治作用可能与下调Smad2和Smad3表达，上调Smad7表达，阻断肝纤维化关键性效应细胞HSC-T6中TGF-β1/Smad信号转导通路而实现。

肉苁蓉-新疆管花肉苁蓉-西域苁蓉

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