肉苁蓉不同提取部位改善肾阳虚大鼠性能力的影响

肉苁蓉不同提取部位改善肾阳虚大鼠性能力的影响

王启新'，陈则华2,罗琥捷2,卢文吉3,李春

［基金项目］国家自然科学基金项目(81673802)

［第一作者］王启新，在读硕士，从事肉苁蓉补肾阳研究,E-mail:wangqixinl25 163.com

［通信作者］*李春，博士，副研究员，从事中药药理研究fTel：010-64286180,E-mail：lichunl9850204 163.com；][屠鹏飞，博士，教授，从事天然产物的物质基础与机制研究,Tel：010-64286180,E-mail：pengfeitu 163.com],屠鹏飞1*

(1.北京中医药大学中药学院中药现代研究中心，北京100029；2.无限极(中国)有限公司，广州510663；3.北京中医药大学中医学院，北京100029)

［摘要1目的：观察肉苁蓉不同提取部位对氢化可的松致肾阳虚模型大鼠性能力的影响。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为正常组、阳虚模型组、肉苁蓉总寡糖组、肉苁蓉总多糖组、肉苁蓉苯乙醇总苷组。连续14 d肌肉注射氢化可的松制备肾阳虚动物模型，给药组按肉苁蓉生药量2.3 g-kg-'对应给予肉苁蓉总寡糖103.82 mg-kg-1,肉苁蓉总多糖115.64 mg-kg'1,肉苁蓉苯乙醇总昔201.48 mg-kg-1水溶液，每日1次。14 d后测定各组大鼠的勃起潜伏期，交配能力各指标(包括捕捉潜伏期、捕捉次数、射精潜伏期、射精次数、捕捉率、射精率等)，脏器湿重及精浆果糖含量，血浆环磷酸腺昔(cAMP)/环磷酸乌昔(cGMP)值，血清激素睾酮(T),雌二醇(EQ,促卵泡生成素(FSH),促黄体生成素(LH)及促性腺激素释放激素(GnRH)水平，观察睾丸病理形态变化。结果：肉苁蓉不同提取部位对肾阳虚大鼠的勃起功能、交配能力、脏器湿重及精浆果糖含量，血浆cAMP/cGMP值，血清激素水平，睾丸病理形态变化均有作用。其中肉苁蓉苯乙醇总昔提取物能够显著缩短大鼠的勃起潜伏期(P<0.05)及捕捉潜伏期(P<0.01),显著增加捕捉次数(P<0.01),睾丸(F<0.05),精囊腺(P<0.01)湿重及精浆果糖含量(P<0.05)，显著升高血浆cAMP/cGMP值(P<0.01)及血清T(P<0.01),FHS(P<0.01),GnRH(P<0.05)水平，显著降低血清E2(P<0.05),LH(P<0.05)水平，显著改善睾丸病理形态。结论：肉苁蓉不同提取部位可通过调控氢化可的松致肾阳虚大鼠模型的激素水平不同程度提高其性能力，其中苯乙醇总昔可显著改善肾阳虚大鼠性能力相关指标。

［关键词］肉苁蓉；肾阳虚；性能力；苯乙醇苷；寡糖；多糖

［中图分类号］R2Q；R22；R285.5［文献标识码］A［文章编号］1005-9903(2018)22-0095-07

［doi］10.13422/j.cnki.syfjx.20182217

［网络出版地址］http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.3495.r.20180829.1313.003.html

［网络出版时间］2018-08-30 11：16

肾阳虚是由于肾阳衰微，命火不足，内生阴寒而出现的腰膝酸软而痛，男子性欲减退、早泄等一类虚寒症状⑴，其典型临床表现为性功能低下⑵。现代研究表明，肾阳虚患者普遍出现性腺功能或储备功能低下的现象⑶，传统的补肾阳中药多具有调节肾阳虚患者下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴功能，进而达到补肾壮阳、提高性能力的效果⑷。其中，肉茄蓉因具有补肾阳、益精血等功效而成为使用频率最高的补肾阳药物，常用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软等证⑴。研究表明肉苁蓉水煎液可显著增加肾阳虚小鼠的体质量，延长肾阳虚小鼠的耐寒时间，提示其具有温补肾阳的作用S〕。此外，临床研究表明肉苁蓉能够通过调节HPG轴功能，促进体内相关递质和激素的释放，提高肾阳虚患者的性能力⑻。因此，肉苁蓉的药效物质基础与作用机制的研究成为开发该药物亟待解决的关键环节，但目前相关的研究报道，尤其是针对肉苁蓉作用物质基础的研究较少。本实验通过建立氢化可的松致大鼠肾阳虚模型，比较肉苁蓉不同提取部位补肾壮阳提高性能力的作用水平，同时初步探究其潜在机制及作用特点，为肉苁蓉物质基础的揭示及后续药物的开发提供实验依据。

1材料

1.1动物50只健康SPF级雄性SD大鼠，体质量（230±20）g,由北京维通利华实验动物技术公司提供,动物合格证号SCXK（京）2016-0006,北京中医药大学动物实验伦理审査编号BUCM4 2017030419-1019。

1.2药物管花肉苁蓉提取物（总寡糖、总多糖、苯乙醇总昔），由北达苁蓉（天津）生物科技有限公司提供;氢化可的松（天津金耀药业有限公司，批号H12020885）；黄体酮（广州白云山明兴例药有限公司，批号H44020229）；苯甲酸雌二醇[哈尔滨三马兽药业有限公司，批号（2012）080232511]0

1.3试剂雌二醇（E?）,人促卵泡生成激素（FSH）,人促黄体生成激素（LH）,睾酮（T）放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号分别为S19973002,S10950154,S10950161,S10940093）;促性腺激素释放激素（GnRH），环磷酸腺昔（cAMP），环磷酸鸟昔（cGMP）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海骞亿生物科技有限公司，批号分别为20180208110723,20180208110724,20180208110725）；精浆果糖定量检测试剂盒（深州市博锐德生物科技有限公司，批号20170801）；苏木素-伊红（HE）染色试剂（北京索宝科技有限公司，批号G4320）。

1.4仪器ME204/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；CL604型电刺激仪（深圳市凯尔隆科技有限公司）;CM1950型冰冻切片机，ICC50HD型光学显微镜（德国Leica公司）。

2方法

2.1肉苁蓉不同提取物的制备肉苁蓉药材为列当科植物管花肉苁蓉Cistanche tubulosa的干燥肉质茎，产地为新疆于田县北京大学肉疝蓉栽培基地。药材的提取与分离具体流程见图1。

2.2动物模型制备⑴每日分别对除正常组外其余各组大鼠肌肉注射氢化可的松注射液25 mg-kg-1,以出现类似肾阳虚证的临床表现为造模成功。正常组每日等量注射生理盐水，连续注射14 d。

2.3动物分组及给药大鼠在用基础饲料适应性喂养3 d后，随机分为正常组、阳虚模型组、肉苁蓉总寡糖组、肉苁蓉总多糖组、肉苁蓉苯乙醇总昔组，每组10只，分笼饲养。造模同时，给药组按肉苁蓉生药量2.3 g-kg'1对应给予肉苁蓉总寡糖103.82 mg-kg"1,肉苁蓉总多糖115.64 mg-kg'1,肉从蓉苯乙醇总昔201.48 mg-kg-1水溶液⑺；正常组和阳虚模型组给予等体积蒸儒水。每日1次，自由饮食，给药共计14 d。

2.4肾阳虚证候表现观察于末次给药后，观察阳虚模型组大鼠是否出现畏寒喜暖、倦缩拱背、精神萎顿、少动闭眼、体毛枯疏、阴囊皱缩、睾丸回升、尾部苍白、肛周污秽、消瘦等一系列类似中医肾阳虚证的证候表现，同时观察肉苁蓉不同提取部位对肾阳虚证大鼠的改善作用，对其证候表现程度进行评分，评分越高证候表现越明显，标准为无现象。分，轻度1分，中度2分，重度3分，极度4分。

2.5指标检测

2.5.1勃起潜伏期测定于末次给药后，将电刺激仪刺激电极置于大鼠阴茎部位，给予4 mA电流，25 V电压的电刺激，记录从刺激开始至阴茎勃起时间为勃起潜伏期"们。

2.5.2交配能力检测于末次给药后进行交配实验。交配实验前，对50只雌鼠进行双侧卵巢切除术,2周后进行实验，实验开始前48 h每只雌鼠注射苯甲酸雌二醇20 jig,4 h前再注射黄体酮500|jig[11]。交配时将雄性大鼠单独放入笼中5 min,使其适应环境，然后每笼放入1只雌鼠。记录20 min内雄鼠的捕捉潜伏期、射精潜伏期（自雌鼠投入至雄鼠第1次捕捉雌鼠和射精的时间），捕捉次数、射精次数、捕捉率、射精率（观测期间各组雄鼠发生捕捉和射精的动物数占组内动物数的百分比）。

2.5.3脏器检测于末次给药后24 h,处死大鼠，取睾丸、附睾、精囊腺称重。剖取精囊腺中精液，放入37 Y恒温箱中液化，5 000 r-min'1离心30 min,分离出精浆，釆用紫外法检测精浆中果糖含量。

2.5.4 ELISA法检测血浆cAMP.cGMP含量于末次给药后24 h,腹主动脉取血，静置，3 500 r-min_1离心10 min分离血浆，采用ELISA检测cAMP,cGMP含量，严格按照说明书步骤操作，计算cAMP/cGMP值。

2.5.5放射免疫法检测血清激素水平于末次给药后24 h,腹主动脉取血，静置，3 500 r-min-1离心10 min分离血清，采用放射免疫法检测T,E2,FSH,LH水平，釆用ELISA检测GnRH水平，严格按照说明书步骤操作。

2.5.6HE染色观察睾丸病理形态取睾丸经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，进行HE染色，光学显微镜下观察睾丸病理形态变化。

2.6统计学处理釆用SPSS 22.0统计软件分析数据，计量资料用斤士s表示，多组均值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用双侧«检验，F<0.05为差异有明显统计学意义。

3结果

3.1肉苁蓉不同提取物的制备按照图1的提取分离流程，对肉苁蓉生药50 kg进行分离提取，共分为3个提取部位，分别为总寡糖、总多糖以及苯乙醇总昔，提取率分别为4.514%,5.028%,8.76%,所有部位来自同一批次同一生产线，共得到2 257 g总寡糖,2 514 g总多糖以及4 380 g苯乙醇总昔3个提取部位的药物。

3.2各组大鼠肾阳虚证候表现观察正常组大鼠活动正常，饮食量逐渐增加，体质量正常增加;阳虚模型组大鼠饮食量减少，体质量显著减轻，体毛稀疏无光泽，精神萎顿，有畏寒喜暖集群现象，注射氢化可的松的部位脱皮后结痂；与阳虚模型组比较，给予肉苁蓉不同提取部位治疗后，各组大鼠的肾阳虚证状有所好转，苯乙醇总昔组大鼠畏寒喜暖状态显著好转，精神及活动行为有所改善，未出现小便清长、阴囊皱缩、睾丸回升、肛周污秽等现象。见表1。

3.3对肾阳虚大鼠性能力的影响

3.3.1对肾阳虚大鼠勃起潜伏期的影响与正常组比较，阳虚模型组大鼠勃起潜伏期显著延长(P<0.01)；与阳虚模型组比较，给予肉苁蓉不同提取部位治疗后，各组大鼠勃起潜伏期均显著缩短(P<0.01)o结果显示肉苁蓉各提取部位均有改善大鼠勃起功能的趋势。见表2。

相比，阳虚模型组大鼠捕捉潜伏期明显延长且捕捉 次数显著减少(P<0.01)；与阳虚模型组比较，给予 肉苁蓉治疗的各组大鼠捕捉潜伏期均显著缩短 (P<0.01),苯乙醇总昔组大鼠捕捉次数显著增加 (P<0.01)；苯乙醇总昔组大鼠捕捉潜伏期与总多 糖组比较，捕捉次数较之总寡糖组及总多糖组显著 增加(尸<0.01)。此外，肉苁蓉苯乙醇总昔也可以 缩短大鼠射精潜伏期，增加射精次数,提高捕捉率及 射精率，但无统计学意义。结果显示肉苁蓉各提取 部位均可改善大鼠交配能力且苯乙醇总苜具有显著 作用。见表3。

4讨论

肾作为人体重要脏腑之一，中医谓其为“先天之本”。肾的精气盛衰，关系到人的生殖和生长发育。肾中精气虚衰，肾阳不足必然影响人的生殖功能，出现阳痿、早泄等性功能减退症状'"J。

交配实验作为性功能的主要评价指标，通过对大鼠捕捉潜伏期、捕捉次数、射精潜伏期、射精次数、捕捉率、射精率的测定，可判定受试物是否具有改善动物性功能的作用'⑶。阴茎勃起功能也是性功能评价的重要指标，阴茎的勃起是由阴茎海绵体充血导致，通过勃起潜伏期的测定，可以反映动物阴茎对刺激的反应速度"妇。本实验结果表明肉款蓉各提取部位均有改善大鼠勃起功能及交配能力的作用，苯乙醇总昔不仅可以缩短肾阳虚大鼠的勃起潜伏期及捕捉潜伏期，同时可以显著增加捕捉次数。

为进一步研究各提取物对性腺和性器官的形态及功能影响，本实验选择对各组大鼠睾丸、附睾、精囊腺湿重进行测定，同时观察睾丸病理形态变化。此外，精囊腺分泌果糖为精子提供主要糖类物质，其含量是判定精子活力和生殖力的重要指标3）。结果发现肉苁蓉不同提取部位可提高肾阳虚大鼠睾丸、附睾、精囊腺湿重，且肉成蓉苯乙醇总昔对大鼠睾丸及精囊腺湿重的增加作用更为显著。

在肾阳虚证候相关指标的改善上，本实验针对阳虚证的病理特征之一cAMP/cGMP值进行了测定'⑹。结果显示肉苁蓉各提取部位均可升高cAMP/cGMP值，调节肾阳虚大鼠下丘脑的神经内分泌功能。

进一步对其可能的上游机制研究发现，肉灰蓉各提取部位功能的发挥与对HPG轴的改善密切相关。HPG轴在动物生殖系统发育调控中扮演重要角色，几乎控制了哺乳动物从胎儿发育、青春期到性成熟整个过程顷。下丘脑分泌GnRH调节垂体FSH,LH的释放,FSH,LH调节性激素T,E2的分泌。同时，性激素对垂体及下丘脑进行负反馈调节。下丘脑、垂体、性腺三者形成的反馈回路共同维持内分泌系统稳定，HPG系统异常会导致动物生殖性能缺陷。肾阳虚证病理基础之一是HPG轴功能障碍和功能低下"旳，进而影响GnRH的分泌以及T分泌不足，最终导致性功能衰退及生精功能障碍〔叫。实验结果表明肉成蓉总寡糖可调节肾阳虚大鼠FSH水平；总多糖对肾阳虚大鼠的E2,FSH,LH具有调节作用；而肉肢蓉苯乙醇总昔对氢化可的松致肾阳虚大鼠紊乱的性激素各水平均具有显著调节作用，并大幅度提高了血清T水平，进而提高肾阳虚大鼠的性能力。

根据文献报道，肉苁蓉总寡糖为肉苁蓉润肠通便的药效物质，但对其除此之外的药理作用研究较少“5。肉苁蓉总多糖具有免疫调节、抗衰老⑵]等药理作用，其机制与清除自由基、提高线粒体的抗氧化能力有关。肉苁蓉苯乙醇总苷显示性激素样作用，并具有抗氧化、改善免疫功能、治疗生精障碍、改善学习认知功能、保护心肌缺血等多种功效m〕。苯乙醇苷类成分是一类由苯乙醇昔元与糖基结合而成的昔类化合物，肉苁蓉中的松果菊苷和毛蕊花糖苷被作为肉苁蓉的指标性成分对药材质量进行控制C24'25]o已有报道显示，管花肉苁蓉中的麦角螢昔（即毛蕊花糖昔）显示雄性激素样作用，从而改善性功能5】。JIANG等:发现，松果菊昔可通过调节类固醇激素合成作用保护大鼠精子和睾丸免受损伤。此外，苯乙醇昔提取物能够改善并恢复生殖损伤后生精上皮的结构和形态,对精子膜的结构及功能具有明显保护作用'刃。对比发现，肉苁蓉总寡糖对肠道的功能调控和总多糖对机体免疫功能调控的作用明显，而肉苁蓉苯乙醇总昔作为肉苁蓉主要的药效物质，对神经内分泌系统的调节作用优势突出，发挥着补肾壮阳提高性能力的显著作用。

本实验通过氢化可的松诱导的肾阳虚模型'制，评价肉茄蓉不同提取部位肉茄蓉总寡糖、总多糖、苯乙醇总昔提取物对肾阳虚模型大鼠性能力的改善作用。结果表明，肉苁蓉各提取部位均能改善肾阳虚大鼠的勃起潜伏期和交配能力，提高睾丸、附睾、精囊腺湿重及精浆果糖含量，升高血浆cAMP/cGMP值，调节血清激素水平，改善肾阳虚大鼠的睾丸病理形态。作为肉疝蓉提取物中主要药效成分的苯乙醇总昔对血清激素水平调节作用更为显著，尤其可以提高肾阳虚大鼠的血清T水平，显著提高肾阳虚大鼠的性能力。本实验为肉苁蓉补肾壮阳的作用机制的阐明和后续药物的开发提供实验依据。

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