肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺蛋白含量与抗氧化功能关系的影响

肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺蛋白含量与抗氧化功能关系的影响

孙云 王德俊 祝瑾 张洪泉

(扬州大学医学院抗炎免疫研究室、组织胚胎学教研室, 扬州 225001)

中国图书分类号R-332;R 282.71;R 339.38;R 341;

R 345;R 563;R 977.9

文献标识码A文章编号1001-1978(2001)01-0101-03

摘要   使用D-半乳糖造成小鼠实验性衰老模型,观察肉苁蓉多糖对实验性衰老小鼠肺胶原蛋白、弹性蛋白含量的影响,对肺组织和红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(M DA)含量的影响。结果灌服肉苁蓉多糖的衰老小鼠的肺组织及红细胞中SO D、G SH-Px活力不同程度提高,肺及血浆中丙二醛含量有所降低。同时肺胶原蛋白含量减少,弹性蛋白含量增多。结论肉苁蓉多糖具有抗氧化性损伤和抗肺衰老的作用。

关键词   衰老;肺胶原蛋白;弹性蛋白;抗氧化功能;肉苁蓉多糖

肺组织随着增龄而呈退行性变化,其表现之一为弹性蛋白减少、胶原蛋白增多,特别是胶原蛋白增多使肺纤维化,肺顺应性下降,呼吸功能衰退。肺脏终生暴露于不利的工作环境并受到伤害性因素(如污染、感染、吸烟等)的影响,这些损伤因素包括了体内形成的氧自由基成分,因此肺抗氧化功能损伤与弹性组织成分变化的关系值得研究。本实验通过使用D-半乳糖造成小鼠糖代谢紊乱,进而损伤机体抗氧化功能诱发衰老,试图弄情实验性抗氧化功能减弱对肺弹性组织成分的影响和肉苁蓉多糖对肺氧化性损伤和弹性组织成分变化的改善作用。

1材料和方法

1.1 D-半乳糖实验性衰老模型[1]及实验设计取ICR小鼠(扬州大学实验动物中心提供,2～3 mon,20～22 g,♀♂各半),随机分为4组,每组20只。

对照组每日灌服生理盐水20 ml·kg-1,正常饲养;模型组和治疗Ⅰ组、Ⅱ组每日皮下注射D-半乳糖50 mg·kg-1·d-1,同时治疗Ⅰ组、Ⅱ组分别给予肉苁蓉多糖50,100 mg·kg-1;模型组灌服生理盐水20ml·kg-1,实验周期40 d。40 d后各组动物取血液、肺组织(匀浆)分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(G SH-P x)活力、维生素E(V itE)和丙二醛(MDA)含量;取肺组织测定胶原蛋白和弹性蛋白。

1.2肺胶原蛋白测定按氯胺-T法[2],将新鲜肺组织酒精脱水12 h,丙酮脱脂48 h。110℃烘干后磨成粉末。取40 mg肺组织干粉加入6 mol·L-1盐酸3 ml,125℃烤箱中水解5 h。加入6 mol·L-1 NaOH2 ml,放置10 h。加入l ml氯胺-T溶液放置20min,加入l ml过氯酸,5 min后加入l ml 10对二甲氨基苯甲醛溶液,60℃水浴中保温20 min。显色,于550 nm波长处比色。根据羟脯氨酸标准曲线和羟脯氨酸占胶原蛋白固定比例计算胶原蛋白含量(mg·g-1肺组织干重)。

1.3肺弹性蛋白测定按刘秉慈的方法[2]将肺组

织在50吡啶水溶液中(4℃)粉碎,3 000×g 10 min离心,去除上清,离心洗涤,真空干燥后浸入液氮,取出研成粉末。于2 mol·L-1 CaCl2中(4℃)持续搅拌24 h,离心洗涤4次,无水乙醇脱脂脱水20 min,2∶1(V/V)氯仿-甲醇浸泡20 min,冷冻干燥,加入胶原酶(组织∶酶=50∶1,w/w),37℃消化10 h,离心、洗涤。加入含有5 mol·L-1盐酸胍、0.05 mol·L-1二硫赤藓糖醇、2.6 mmol·L-1 EDTA的0.1 mol·L-1 Tris缓冲液(pH 8.5)中。通氮,加塞,37℃10h,离心洗涤2次,再加入含6 mol·L-1脲素,34.7 mmol SDS及含0.05·L-1二硫赤藓糖醇0.05 mol·L-1缓冲液(pH 7.7)中,通氮,加塞,37℃10 h,离心洗涤后再重复1次,残渣冷冻干燥,测蛋白质含量(Low ry法)即为弹性蛋白含量(mg·g-1肺组织)。1.4肺组织和血液中SOD、GSH-Px、Vit E和MDA的测定取新鲜肺组织,用50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)制成10肺匀浆,分别取全血(测定M DA和Vit E)并制成红细胞抽提液(测SOD和GSH-Px),用试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所提供)测定SOD,GSH-Px、V it E和MDA含量。

2结果

2.1实验性衰老小鼠肺胶原蛋白、弹性蛋白含量变化及肉苁蓉多糖的影响D-半乳糖连续注射40 d后,模型组小鼠肺胶原蛋白含量增多,弹性蛋白含量减少。肉苁蓉多糖治疗Ⅰ组对衰老小鼠肺胶原蛋白含量有所降低,但差异无显著性;治疗Ⅱ组(100 mg·kg-1·d-1×40 d)可明显抑制D-半乳糖引起的肺弹性组织成分改变。肉苁蓉多糖两个治疗组对弹性蛋白均有改善作用(见表1)。

2.2实验性衰老小鼠血液及肺中SOD、GSH-Px、Vit E、MDA含量变化及肉苁蓉多糖的影响D-半乳糖实验性衰老小鼠血液和肺组织抗氧化性物质含量少于对照组,脂质过氧化物(M DA)浓度增多。肉苁蓉多糖2个剂量组可不同程度抑制D-半乳糖引起的机体抗氧化功能减弱及造成的氧化性损伤(见表2,表3)。

3讨论

呼吸系统退行性变化在人体的衰老过程中发生较早,可能与它直接与外界环境接触,易受伤害性因素,特别是氧自由基的损伤有关。随着增龄,肺活量下降速度较快。这与其弹性功能老化有关。氧自由基损伤在肺老化中起重要作用,肺组织细胞的损伤或死亡通常为胶原所取代,进而造成肺弹性蛋白逐渐减少,胶原蛋白逐渐增多使肺不断纤维化,其后果是肺顺应性降低,通气功能衰退。

D-半乳糖在一定时间内连续注射使机体细胞内半乳糖浓度增高,在醛糖还原酶催化下还原成半乳糖醇,这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内,造成细胞代谢紊乱,破坏并消耗了机体抗氧化物质,并不断产生自由基导致组织细胞受损[3]。在本试验中D-半乳糖引起血液和肺组织中抗氧化物质SOD、GSH-P x、V it E明显减少和脂质过氧化产物(MDA)产生增多同时造成肺胶原蛋白含量增多、弹性蛋白含量减少,提示实验性氧化和抗氧化功能失衡可导致肺纤维化。有实验表明自由基在体外能明显促进纤维细胞增殖和胶原合成[4]。在体内的抗氧化物质中,SOD能清除超氧阴离子(O-)保护细胞免受损伤;GSH-P x能特异地催化还原型谷胱甘肽(G SH)对过氧化氢的还原反应,从而起到保护细胞膜结构和功能的完整性;V it E是天然脂溶性抗氧化剂,主要存在于细胞膜性结构中,Vit E不但是单线态氧(1O 2)和O-的清除剂,更重要的是脂质过氧化作用的阻断剂,Vit E与GSH-Px协同保护细胞膜免受脂质过氧化损伤。对衰老机体来讲,为防止渐进性自由基损伤和肺纤维化,不断补充抗氧化物质,调节机体氧化与抗氧化功能的平稳显得作常重要[5,6]。