摘要：目的研究肉苁蓉提取工艺条件及其神经保护作用。方法利用生物酶对肉苁蓉进行提取，通过单因素试验优选工艺条件，提取液经卷式膜纯化，冷冻干燥后获得肉苁蓉提取物，并对其进行抗氧化活性测试，再采用斑马鱼体内试验评价肉苁蓉提取物对斑马鱼中枢神经损伤的保护作用。结果最优工艺为加8倍量纯化水，温度为45~50°C,调整pH为7.0,加入药材质量0.1%的中性蛋白酶，搅拌2h,煮沸灭活后，经微滤卷式膜进行过滤，收集透过液。所制备的肉苁蓉提取物收率在60%以上，肽含量不低于20%,总苷含量在7%左右，糖类成分在63%左右。抗氧化活性测试表明肉苁蓉提取物对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并嚷喳-6-磺酸)(ABTS)自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除作用(/Go值分别为314.9ng・mLT和393.5 Hg-mL_1),斑马鱼体内活性实验表明肉苁蓉提取物对斑马鱼中枢神经损伤具有较好的保护作用。结论该工艺具有绿色环保、操作简便等优点，所制备的肉苁蓉提取物具有较好的抗氧化和神经保护作用。

关键词：肉苁蓉提取物；生物酶；肽；抗氧化；神经保护

中图分类号：R284.2,R285.5文献标识码：A文章编号：1672-2981(2019)12-2020-07

doi:10.7539/j.issn.l 672-2981.2019.12.002

肉苁蓉的功效与作用：神经保护作用1.jpg

苁蓉，又名大芸，主产于内蒙古自治区阿拉善盟和新疆维吾尔自治区的塔克拉玛干沙漠。中医称其为地精或金笋，是极其名贵的中药材，素有“沙漠人参”之美誉，历史上就被西域各国作为上贡朝廷的珍品'5。沙漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma和管花肉苁蓉Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight是主要品种，已被《中国药典＞（2015年版一部）收录⑶。肉苁蓉具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，主治男子阳痿，女子不孕、带下、血崩，腰膝冷痛，血枯便秘等'磚。在历代增力中药处方中出现率占第1位，而在抗老防衰类方剂中仅次于人参，占第2位件皿。肉苁蓉在我国已有两千多年的使用历史，现代药理学研究表明，肉苁蓉除能补肾壮阳外，更兼有抗衰老、增强记忆力、提高免疫力等多种功能叩。

从20世纪80年代开始，国内外对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究，结果证实了苯乙醇苷类、糖类、蛋白类为肉苁蓉的主要成分叩叫。苯乙醇苷类具有抗氧化、抗衰老、调节神经内分泌系统等生物活性；糖类物质可以提高小肠推进度，达到通便润燥的功效，同时还有提高记忆力的作用［，5-，9）;蛋白类成分约占肉苁蓉药材的10%〜20%,可以提高机体免疫力，增强体质四。目前获得苁蓉提取物最普通的方法是水提取法和有机溶剂提取法，两种方法可以将苁蓉中的苯乙苷类和糖类成分提取出来，但蛋白类成分很难提取彻底，而且两种方法需要多次提取，得率不高，造成资源利用率低。

为了简化肉苁蓉提取物的制备工艺，避免有毒试剂的使用，提高肉苁蓉提取物的收率，同时满足大规模生产，本文拟研究肉苁蓉的提取工艺，并期望获得的肉苁蓉提取物中富含较易吸收的小分子肽类、苷类和糖类成分，再通过斑马鱼体内实验评价肉苁蓉提取物的神经保护作用。

1材料

R-210型旋转蒸发仪、V-700型真空隔膜泵、KV36快速消解仪和K-360凯氏定氮仪（瑞士步琪公司）,RET control-vise磁力搅拌器（德国1KA公司），A300全自动氨基酸分析仪（德国曼默博尔公司），1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司），Lambda 35型紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司），Milli-Q Reference纯水机（美国Millipore公司），XS-205型1/10万电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），FreeZone型冷冻干燥机（美国Labconco公司）。肉苁蓉药材（浙江南方药材有限公司，经台湾国防医学院林汉钦教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma干燥的肉质茎，符合2015年版《中国药典》规定，样品编号20180122,并将其粉碎过四号筛网），D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号:110833-2012050,纯度：99.9%）,松果菊苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111670-201706,纯度：89.7%）,菠萝蛋白酶（酶活力为30万U理-'）、木瓜蛋白酶（酶活力为40万U・g7）、中性蛋白酶（酶活力为30万U•&-'）、碱性蛋白酶（酶活力为20万U・g—'）以及酸性蛋白酶（酶活力60万U・g7）均为食品级，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2方法

2.1提取工艺中工具酶的備选

釆用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶对肉苁蓉进行提取，具体步骤为：取100g肉苁蓉药材，固定料液比1：6（g/mL）加入纯化水，用浓度均为1 mol•L'的盐酸和氢氧化钠调节每种酶的最适pH,加入药材质量0.05%的蛋白酶，在各个酶的最适温度恒温搅拌。反应1、2、4、6、8、10h时取样10 mL,煮沸灭活，离心过滤后，取滤液，测定肽、总苷和总糖含量，作含量与提取时间的变化曲线。

2.2酶提取工艺单因素考察试验

考虑到生物酶法制备肉苁蓉提取物的影响因素，设计考察5个单因素：时间、酶用量、料液比、温度、pH值。

2.3肽含量测定

2.3.1酸溶性蛋白质含量的测定精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量至10 mL量瓶中，加适量15%三氯乙酸，充分溶解后，再加15%三氯乙酸至刻度。过滤后，取全部滤液按凯氏定氮法测定可溶性蛋白质的含量。

2.3.2游离氨基酸含量的测定精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加pH=2.2的柠檬酸钠缓冲溶液制成100 mg-mL-'的肉苁蓉提取物溶液，用氨基酸自动分析仪以外标法测定氨基酸的含量。

2.3.3肽含量的测定酸溶性蛋白与游离氨基酸测定值的差值即为肽含量。

2.4苁蓉总苷的含量测定网

2.4.1松果菊苷

①色谱条件：采用YMC-Pack Pro C18色谱柱（4.6 mmX 150 mm,5 pm）,流动相甲醇-0.15%醋酸水溶液（30:70）,流速1.0 mL-min-1,检测波长333 nm,柱温40°C,进样量10 pLo

②对照品溶液：精密称取松果菊苷对照品适量，加50%甲醇制成0.1mg-mL-'（经折算后）的溶液。

③供试品溶液：精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加50%甲醇适量制成0.3 mg,mL 1的肉苁蓉提取物溶液。

④测定法：分别取对照品溶液与供试品溶液各10 HL,注入高相液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法计算松果菊苷的含量。

2.4.2苁蓉总苷

①对照品溶液：精密称取松果菊苷对照品适量，加50%甲醇制成O.lmg-mL^'（经折算后）的溶液。

②供试品溶液：精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加50%甲醇适量制成20 ng•mL■1的肉苁蓉提取物溶液。

③标准曲线的制备：精密移取对照品溶液1、2、3、4、5 mL置50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，按紫外-可见分光光度计法测定，在333 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

④测定法：取供试品溶液在333 nm波长处测定吸光度，从标准曲线读取含量，按照下式计算苁蓉总苷的含量，即得。=（Qt一0）X（624/786）+Q为肉苁蓉提取物中苁蓉总苷的含量（%）;Ct为以松果菊苷为对照测得肉苁蓉提取物冻干粉中苁蓉总苷的含量（%）；Qe为高效液相色谱法测得肉苁蓉提取物冻干粉中松果菊苷的含量（%）。

2.5总糖的含量测定

2.5.1对照品溶液精密称取。-无水葡萄糖对照品适量，加纯化水适量制成100 Hg-mL-1的溶液。

2.5.2供试品溶液精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加纯化水适量制成50 gg•mL 7的肉苁蓉提取物的溶液。

2.5.3标准曲线的制备精密移取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分别置于25 mL比色管中，准确补纯化水至2 mL,加入1.0 mL苯酚溶液（50 mg•mL-1）,混匀后，小心加入浓硫酸5 mL,再煮沸2min,取出10 min后，在波长489 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。2.5.4测定法分别精密移取“2.5.1”项下对照品溶液1.010£和纯化水1.0血置于25 1111比色管中，加入1.0 mL苯酚溶液（50 mg-mL-1）,混匀后，小心加入浓硫酸5.0mL,再煮沸2 min,取出10 min后，在波长489 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算总糖含量。

2.6抗氧化能力的测定

2.6.1DPPH自由基清除能力准确称取DPPH粉末适量，用无水乙醇溶解并定容，配制浓度为40瞄•mL-'的DPPH乙醇溶液。精密称取抗坏血酸（阳性对照）以及肉苁蓉提取物冻干粉适量，分别用乙醇溶解并定容,配制样品乙醇溶液。移取2mL样品乙醇溶液和2mL DPPH乙醇溶液混合均匀（4）；移取2 mL供试品溶液和2mL乙醇混合均匀（*）；移取2 mLDPPH溶液和2 mL乙醇混合均匀（/（））,室温放置30 min,在515 nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率（/穴）：压％=[1—（4—W）/4）]xioo%。

2.6.2ABTS自由基清除能力准确称取适量ABTS粉末用纯化水溶解并定容，制成4 mg-mL-1的ABTS溶液。准确称取适量过硫酸钾用纯化水溶解并定容,制成4 mg-mL-1的过硫酸钾溶液。移取352 pL过硫酸钾溶液加入至20 mL ABTS溶液中，摇匀，静置过夜后移取1 mL与65 mL PBS缓冲溶液混匀,制成ABTS工作液。精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，用纯化水溶解并定容，配制样品溶液。准确移取0.5 mL样品溶液和5mLABTS工作溶液混合均匀（其）；准确移取0.5 mL样品溶液和5 mL PBS缓冲液混合均匀（4）;准确移取5 mL ABTS工作溶液和0.5 mL PBS缓冲液混合均匀（/。），立即在734nm处测定吸光度，计算自由基清除率，计算公式同“2.6.1”项下。

2.6.3超氧阴离子自由基清除能力（SRSA）准确移取1 mLO.l moL•L_1 PBS缓冲液（pH=7.4）于量瓶中，加入1 mL 150（imoL•'氯化硝基四氮哩

蓝（NBT）溶液，2mL468 pmoL•还原型辅酶I（NADH）溶液，1 mL60 nmoL•L-'过一硫酸盐（PMS）溶液，搅拌均匀，25°C下反应5 min,制成工作液。精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，用PBS缓冲液溶解并定容，配制样品溶液。准确移取0.5 mL样品溶液和5 mL工作溶液混合均匀（瓦）；准确移取0.5 mL供试品溶液和5 mL纯化水混合均匀（*）;准确移取5 mL上述工作溶液和0.5 mL纯化水混合均匀（&）,立即在560 nm处测定吸光度，并计算自由基清除率,计算公式同“2.6.1”项下。

2.7对斑马鱼神经损伤保护作用的评价

2.7.1实验动物野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后1 do以上斑马鱼均饲养于28°C的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率：480〜510瞄•cm J；pH为6.9〜7.2;硬度：53.7-71.6 mg•L"1CaCO3）,实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171o饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

肉苁蓉提取工艺优化及其神经保护作用的分析_03.png 肉苁蓉提取工艺优化及其神经保护作用的分析_04.png 肉苁蓉提取工艺优化及其神经保护作用的分析_05.png

4结论

肉苁蓉作为我国的传统中药，具有多种药理活性,其活性成分有蛋白质、总苷和糖。本文建立肉苁蓉提取物的制备工艺，即将肉苁蓉药材使用生物蛋白酶进行酶提取，提取液经卷式膜纯化，浓缩冷冻干燥后得到肉苁蓉提取物。此工艺具有以下优点：①蛋白酶的加入使药材中的蛋白质转化成具有水溶性好并且具有多种功能的肽类成分，所制备的提取物中肽类成分约为20%,同时也提取得到原药材中的总苷和糖类成分；②肉苁蓉提取物的得率在60%以上，与传统工艺的水提工艺相比(40%左右)网，得率显著提高，从而降低成本，提高了资源利用率；③提取温度适中，具有耗能低的特点，也避免了有效成分的破坏；④酶提取液经卷式膜进行纯化，减少了提取物中的杂质，提高了有效成分的含量。

此外，为进一步探索对肉苁蓉提取物的开发价值，本文研究了其抗氧化活性及对斑马鱼神经损伤的保护作用。结果表明肉苁蓉提取物对ABTS和SRSA自由基具有较强的清除作用(/G。值分别为314.9 Hg-mL~'?n 393.5 ng-mL_,),M DPPH自由基显示为中等清除作用，并且对斑马鱼中枢神经损伤具有较强的保护作用。因此，肉苁蓉提取物对于神经保护的作用机制值得深入研究，同时，斑马鱼模型与现有模型的相关性也需深入开展。

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