肉苁蓉乙醇提取物抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及其机制

肉苁蓉乙醇提取物抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及其机制

由淑萍1，赵军2，马龙1，木克热木·吐地买提1，张石蕾1，刘涛1

（1.新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室，新疆乌鲁木齐830011；

2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004）

摘要：目的探讨肉苁蓉乙醇提取物肉苁蓉苯乙醇样糖苷（CPhG）对大鼠免疫性肝纤维化的作用及其作用机制。方法SD大鼠75只肉苁蓉提取工艺优化及其神经保护作用的分析，随机分为正常对照组、模型组、复方鳖甲软肝片（0.6 g·kg-1）阳性药对照组、CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1组，CPhG组每组13只，其他每组12只，皮下和尾静脉注射牛血清白蛋白诱导大鼠肝纤维化模型，造模同时ig给予相应药物，每日1次，共15周。测定大鼠肝指数，Masson染色法观察肝组织纤维化，全自动化分析仪测定血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量变化，羟脯氨酸（HyP）测定试剂盒测定肝匀浆中HyP含量的变化；免疫组化法观察肝组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的变化。结果与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数显著升高（P<0.05）。模型组大鼠肝组织胶原纤维延伸连接，包绕整个肝小叶使正常肝小叶结构破坏，大方型假小叶形成；模型组大鼠血清中GPT，GOT，ALP，TP和ALB含量及肝匀浆中HyP含量显著升高（P<0.05，P<0.01），Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1能降低肝纤维化大鼠肝指数（P<0.05），肝组织形态与正常对照组接近，血清中GPT，GOT，ALP，TP和ALB含量及肝匀浆中HyP含量降低（P<0.05，P<0.01），且能抑制肝组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达（P<0.05，P<0.01）。结论CPhG能降低免疫性大鼠肝纤维化程度，其机制可能与降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达进而抑制肝星状细胞活化、减少胶原生成有关。

关键词：肉苁蓉；苯乙醇样糖苷；肝纤维化；胶原蛋白

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1000-3002（-2016）05-0504-07

DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.004

肉苁蓉属（Cistanche）植物是著名的名贵补益类中药。因其疗效确切，药性温和，所以自古就被视为强壮、滋补的中药，有“沙漠人参”之美誉。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们的关注。化学及药理学研究显示，肉苁蓉肉苁蓉苯乙醇样糖苷（Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhG）是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一［1-2］。CPhG具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性［3-6］。Peter于1989年首次发现CPhG类化合物松果菊苷具有显著的保肝护肝作用，随后引起人们对CPhG进行抗肝纤维化研究的兴趣。本课题组的前期研究已经发现，肉苁蓉的肉质茎部提取物类叶升麻苷和异类叶升麻苷，对于体外免疫性肝损伤模型和HepG2.2.15细胞模型均有较好的肝保护作用和抗乙肝病毒作用［7］，但对于CPhG抑制肝纤维化的进程及抗肝纤维化的具体机制还未明确。本研究对大鼠皮下和尾静脉注射牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）制备免疫性肝纤维化模型，评价肝损伤及纤维化的程度，以探讨CPhG保肝、抗肝纤维化的作用及其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1试剂和仪器

管花肉苁蓉（C.tabulosa）新鲜肉质茎6.0 kg，

70%乙醇热回流提取3次，每次3 h，合并提取液。AB-8树脂纯化得到苯乙醇样糖苷提取物即CPhG类化合物，经新疆维吾尔自治区药物研究所赵军研究员用高效液相色谱法鉴定为CPhG，纯度为70%。用0.5%羧甲纤维素钠（CMC-Na）将药物配制成不同浓度，置4℃冰箱保存待用。复方鳖甲软肝片（compound Biejia-rangan tablets，BJRG）

2结果

2.1肉苁蓉乙醇提取物对BSA致肝纤维化大鼠体质量和肝指数的影响

由表1可见，与正常对照组比较，模型组大鼠体质量减轻，肝指数增加（P<0.05）；与模型组比较，BJRG组及CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1组大鼠体质量增加，肝指数下降（P<0.05），表明注射BSA后大鼠肝细胞受损，CPhG对大鼠肝损伤具有一定的防护作用。

2.2肉苁蓉乙醇提取物对BSA致肝纤维化大鼠肝组织纤维化的影响

由图1可见，正常对照组大鼠肝组织并无异常，未见炎细胞浸润，肝小叶结构完整清晰，肝细胞呈索状分布，未见有不规则血窦，汇管区无扩大。模型组大鼠呈Ⅲ~Ⅳ级纤维化，胶原纤维延伸链接，包绕整个肝小叶使正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方型假小叶为主。阳性药BJRG组和CPhG组治疗效果显著，病理组织切片示形态基本上与正常对照组接近。

根据Masson染色的肝纤维化标准评分，与正常组比较，模型组肝纤维化程度显著增加（P<0.01）；阳性药BJRG组和CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1组肝纤维化程度显著低于模型组（P<0.01）。Ridit分析表明，CPhG对免疫性肝纤维化有防治作用（表2）。

2.3肉苁蓉乙醇提取物对BSA致肝纤维化大鼠肝功能的影响

表3可见，与正常对照组比较，模型组大鼠血清

GPT，GOT和ALP活性及TP含量显著增加（P<0.05，P<0.01），ALB含量显著降低（P<0.05）；与模型组比较，BJRG组和CPhG组大鼠血清GPT，

Tab.4 Effect of CPhG on hydroxyproline（HyP）content of hepatic fibrosis rats induced by BSA

GOT和ALP活性及TP含量降低（P<0.05，P<0.01），ALB含量增加（P<0.05，P<0.01）。表明CPhG对BSA诱导的大鼠肝细胞损伤具有一定的防护作用。

2.4肉苁蓉乙醇提取物对BSA致肝纤维化大鼠肝组织中HyP含量的影响

表4结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织中HyP含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1组和BJRG组Group Survival rat HyP/HyP含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。表明CPhG减少了细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝内的沉积。

2.5肉苁蓉乙醇提取物对BSA致肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响

表5可见，与正常对照组相比，模型组肝组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达升高（P<0.01）。与模型组相比，阳性药BJRG组和CPhG 0.125，0.25和0.5g·kg-1组大鼠肝组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达降低（P<0.05，P<0.01），其中以CPhG 0.5 g·kg-1组最为显著。表明CPhG对大鼠肝纤维化具有预防及治疗作用，能减轻大鼠胶原纤维增生程度，与肝组织形态观察结果一致。