山茱萸⁃肉苁蓉药对治疗帕金森的网络药理学研究一

于迎春，赵阳，梁素萍，郑景辉∗

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁５３０００１）

帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是一种进行性、多灶性神经退行性疾病，约１％的６０岁以上人群受其影响［１］，其发病率随年龄增长逐渐升高。目前，ＰＤ的病因未明，其具体发病机制尚不明确，主要认为与神经炎症、氧化应激、基因突变、免疫学异常、细胞凋亡、线粒体损伤等有关［２⁃４］。临床上ＰＤ最常用的治疗方案是多巴胺替代疗法，但只控制临床运动症状，不能阻止疾病的进展，且长期的药物治疗可能导致严重的、不可逆的运动并发症。其他治疗方法主要包括外科治疗，如毁损手术、脑深部剌激等，干细胞疗法［５］，中医针灸、运动疗法、音乐疗法等辅助疗法治疗ＰＤ，但均不可以彻底治愈。

山茱萸⁃肉苁蓉药对来源于地黄饮子，出自于《黄帝内经·素问·宣明论方》，为补肾化痰名方，具有滋阴、补阳、开窍化痰之功效，山茱萸、肉苁蓉阴阳并补，共为君药，两药相使为用，发挥功效，其中山茱萸具有补益肝肾、收涩固脱等功效，现代药理学研究表明其具有明显的抗氧化、抗炎杀菌、降血糖等功效。肉苁蓉具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效，现代药理学研究表明肉苁蓉具有神经细胞保护、抗氧化、抗衰老、调节免疫等作用。目前山茱萸⁃肉苁蓉药对在临床治疗帕金森病中广泛应用，但其治疗帕金森的确切机制尚不明确，本研究采用网络药理学的方法，通过相关数据库对山茱萸⁃肉苁蓉药对所包含的有效成分及作用靶点进行筛选，并将其靶点与帕金森疾病靶点进行匹配，筛选出山茱萸⁃肉苁蓉治疗ＰＤ相关的关键作用靶点，并进一步分析其治疗ＰＤ的物质基础和作用机制。

１材料与方法

１１山茱萸与肉苁蓉药物成分信息获取及整理使用中药系统药理学数据库和分析平台（ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓｙｓｔｅｍｓｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｄａｔａｂａｓｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｐｌａｔｆｏｒｍ，ＴＣＭＳＰ）收集中药山茱萸、肉苁蓉的化合物，并以口服生物利用度（ｏｒａｌｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ＯＢ）≥３０％、类药性（ｄｒｕｇｌｉｋｅｎｅｓｓ，ＤＬ）≥０１８，因有研究发现帕金森病患者血脑屏障受损［６］，故设定血脑屏障通透性（ＢＢＢ）≥－０８５，为限定条件对所收集到的化合物进行筛选，将最终筛选出的化合物建立有效化合物数据库。

１２山茱萸⁃肉苁蓉药对作用靶点的预测运用中药分子机制生物信息学分析工具（ａｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＢＡＴＭＡＮ⁃ＴＣＭ）（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｎｅｔ．ｎｃｐｓｂ．ｏｒｇ／ｂａｔｍａｎ⁃ｔｃｍ／ｉｎ⁃ｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｈｏｍｅ／Ｉｎｄｅｘ／ｉｎｄｅｘ）对运用ＴＣＭＳＰ筛选出的山茱萸⁃肉苁蓉药有效化合物作用靶点进行预测。

１３有关帕金森病相关基因筛选将“Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ”作为检索词，通过ＧｅｎｅＣａｒｄｓ数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／）检索帕金森病相关靶点。ＧｅｎｅＣａｒｄｓ数据库通过Ｇｉｆｔｓ算法，能够准确计算靶点与疾病的相关度，并按照相关度进行评分排序。本研究选取其中最低分超过２０分的前２３７位靶点进行研究，其中最高分１４６４７分，并摘录相应的靶点的标准基因名。

１４山茱萸⁃肉苁蓉对帕金森病作用靶点的预测及ＰＰＩ网络构建首先将预测所得的山茱萸⁃肉苁蓉药对作用靶点与筛选出的帕金森相关发病靶点导入ＶＥＮＮＹ２１（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｇｐ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｖｅｎｎｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ），得出两者共同靶点，即可能作用于帕金森病的靶点。后将所得共同靶点与其化合物相对应，使用Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３６１软件做出化合物⁃靶点图。并将山茱萸⁃肉苁蓉药对作用于帕金森病的靶点上传至ＳＴＲＩＮＧ１０５数据库中（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ⁃ｄｂ．ｏｒｇ），选择研究物种为“Ｈｏｍｏ⁃ｓａｐｉｅｎｓ”（智人），设定靶点间最低联系分数为０４分，隐藏无相互关联的靶点，获得靶点联系网络图，最后将该图导入Ｃｙ⁃ｔｏｓｃａｐｅ３６１软件中构建ＰＰＩ网络图。

１５山茱萸⁃肉苁蓉对帕金森病作用靶点的ＧＯ分析和ＫＥＧＧ分析将山茱萸⁃肉苁蓉对帕金森病作用靶点导入ＤＡＶＩＤＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＲｅｓｏｕｒｃｅｓ６８数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｓｕｍｍａｒｙ．ｊｓｐ），选择其中分子功能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ）、生物过程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｐｒｏｃｅｓｓ）和细胞成分（ｃｅｌ⁃ｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）３项对山茱萸⁃肉苁蓉作用于帕金森病的靶点进行ＧＯ富集分析，筛选具有显著差异的生物过程及可靠的靶点通路，并且使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７软件将ＧＯ富集分析满足Ｐ＜００５的结果做成可视化条形图。选择ＫＥＧＧ进行靶点基因通路注释分析，将得到的结果且满足Ｐ＜００５作为重要通路用Ｏｍｉｃｓｈａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｃｓｈａｒｅ．ｃｏｍ／）制作成可视化气泡图。

２结果

２１山茱萸⁃肉苁蓉活性成分的筛选通过ＴＣＭＳＰ数据库检索山茱萸及肉苁蓉的所有化合物（截止时间至２０１８年１２月），并按照口服生物利用度（ｏｒａｌｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ＯＢ）≥３０％、类药性（ｄｒｕｇｌｉｋｅｎｅｓｓ，ＤＬ）≥０１８和血脑屏障通透性（ＢＢＢ）≥－０８５作为筛选条件，筛选获得山茱萸的潜在活性成分１６种，肉苁蓉潜在活性成分６种，见表１。

２２山茱萸⁃肉苁蓉化合物作用靶点的预测将山茱萸⁃肉苁蓉化合物的ＰｕｂｃｈｅｍＣｉｄ代码上传至ＢＡＴＭＡＮ⁃ＴＣＭ数据库平台，并设置相似性模型阀值为“Ｓｃｏｒｅｃｕｔｏｆｆ＝２０”，得到各化合物所对应的潜在靶点，并按照返回靶点的得分顺序排列，选各化合物取前２０个靶点，不足２０全部纳入，并去除重复靶点后，最终得到山茱萸化合物作用靶点１６４个，肉苁蓉化合物作用靶点９４个。

２３帕金森病发病靶点筛选通过ＧｅｎｅＣａｒｄｓ数据库共检索“Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ”，共获得５５９７个可能引起帕金森病相关的靶点，其中ＳｙｎｕｃｌｅｉｎＡｌｐｈａ类靶点相关度最高（１４６４７分），本研究选取其中相关度得分≥２０分的靶点，共筛选获得２３７个相关靶点。

２４山茱萸⁃肉苁蓉作用于帕金森病靶点预测将将预测的山茱萸⁃肉苁蓉化合物靶点及筛选得出帕金森病相关基因靶点，全部以基因名格式导入ＶＥＮＮＹ２１软件中，取两者的交集，得出１９个化合物与疾病共同靶点，１９个具体靶点信息见表２，得出的韦恩图如图１所示。

２５化合物⁃靶点网络图的构建将山茱萸、肉苁蓉药对与其２１种活性成分和１９个关键靶点基因，导入Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３５１软件构建山茱萸⁃肉苁蓉治疗帕金森病药物⁃化合物⁃靶点相互作用的可视化网络图，结果见图２。

结果显示，有效化合物中ｄｉｏｐ（邻苯二甲酸二异辛酯）、ｍａｒｃｋｉｎｅ（丁哌卡因）、ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（槲皮素）、ｙａｎｇａｍｂｉｎ（鹅掌楸树脂醇ｂ二甲醚）、ｅｔｈｙｌｏｌｅａｔｅ（ＮＦ）（油酸乙酯）、ｃｏｒｎｕｄｅｎｔａｎｏｎｅ（角豆酮）、３，４⁃ｄｅｈｙｄｒｏｌｙｃｏ⁃ｐｅｎ⁃１６⁃ａｌ上述７种成分能与２个及以上的疾病靶点基因联系，可能是山茱萸⁃肉苁蓉治疗帕金森病的重要成分，可知３０山茱萸⁃肉苁蓉治疗帕金森病是多成分、多靶点共同作用。２６关键靶点的ＰＰＩ网络构建及分析将山茱萸⁃肉苁蓉治疗帕金森病的１９个靶点基因导入Ｓｔｒｉｎｇ数据库获取蛋白质相互作用关系，由Ｓｔｒｉｎｇ数据库得到靶点相互作用网络图，结果如图３所示，其中“边”代表作用靶点之间的关联，节点代表作用靶点。图中共１９个节点，７０条边，平均节点度为７７３，平均局部聚类系数０６６１。靶标均以圆形节点表示，靶标之间连线越粗说明在治疗帕金森病靶标网络中的该靶点越重要。