新疆肉苁蓉多糖提取的试验方法

新疆肉苁蓉[Cistanche deserticola(Y.C.Ma.)]多寄生于红柳、白刺、梭梭的根部,是我国名贵中药,被誉为“沙漠人参”【2】。肉苁蓉多糖为肉苁蓉的主要生物功能活性成分之一,但是对于肉苁蓉多糖是否有清除自由基的作用未见报道。本文采用光谱分析的方法,测定了肉苁蓉多糖对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPP H·自由基、单线态氧4种自由基的清除作用,从而对其抗氧化活性做出评价,为充分开发利用这一天然资源提供科学依据。

实验方法

2.2.1肉苁蓉多糖的提取方法

取30g肉苁蓉粉末,置于500m L锥形瓶中,分别用石油醚(60—90℃)、乙醚和体积分数80%乙醇热溶液(30℃)浸泡6h,残渣挥干溶剂。在滤渣中按固液比1∶10加水浸泡24h,加热30℃提取100min,提取结束后,离心获得上清液。上清液经减压浓缩后加入3倍体积的95%乙醇沉淀,4℃下静置24h,离心后收集沉淀,真空干燥即可获得肉苁蓉粗多糖。称取1.00g粗多糖,用水溶解并定容于50m L容量瓶中,待测备用。

2.2.2肉苁蓉多糖对O-·自由基清除能力的试验

利用多巴胺自氧化产生超氧自由基(O-·)试验肉苁蓉多糖对O-·的清除能力[3]。干燥带刻度试管依次加入0.1mm ol/L pH=10.12碳酸盐缓冲液3.0m L、水3.0m L、不同浓度的多糖样品溶液0.5m L,置于30℃水浴中预热5min后,加入在30℃水浴中预热过的2.0mmol/L多巴胺1.0m L,立即混匀计时,30℃保温反应5min,立即用2滴10m ol/L HCl中止反应。用缓冲液作参比,在221nm处测吸光度(A样),空白组以0.5m L水代替样品(A空白),对照组以0.5m L抗坏血酸代替样品,每一样品平行测3次,取其平均值。

O2·清除率(%)=(A空白-A样)/A空白×100%

2.2.3肉苁蓉多糖对·O H自由基清除能力的试验

采用EDTA-Fe(Ⅱ)-亚甲基蓝-H2 O2体系试验肉苁蓉多糖对羟自由基清除能力。原理为EDT A-Fe(Ⅱ)与过氧化氢发生类Feton反应产生·O H自由基,使亚甲基蓝溶液在660nm特征吸收峰降低。在系列10m L具塞试管中,加入5mm oL/L FeSO4溶液1.0m L、5m mo L/L EDTA溶液1.2m L0.03m ol/L Na H2 PO4-N a2 HPO4(pH=7.4)缓冲溶液2.0m L、20mm ol/L过氧化氢溶液1.3m L,摇匀后,加入0.2m mol/L的亚甲基蓝溶液0.7m L,然后分别加入不同浓度的待测液、维生素C 1.0m L,用水稀释至10.00m L,混匀后于37℃保温30min,于660nm处测定各溶液吸光度值,空白组以水代替样品液。每一样品平行测3次,取其平均值。

样品对·O H自由基清除率(%)=[(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中:A0——未损伤管的吸光度值;A1——损伤管的吸光度值;A2——加入样品后的吸光度值。

2.2.4肉苁蓉多糖对DPPH·清除能力的试验

取0.1m L的肉苁蓉多糖溶液加入5.0m L DPP H·溶液中,迅速混匀,室温下静置10min后,测定其在517nm波长的吸光度变化[4]。每一样品平行测3次,取其平均值。

样品对DPPH·的清除率(%)=1-[(A-B)/A0]×100%

式中:A0——未加样DPP H·(1.9m L DPP H·+0.1m L 50%乙醇)的吸光度值;A——样品与DPPH·反应后的吸光度值;B——空白样品(样品0.1m L+1.9m L 50%乙醇)的吸光度值。

2.2.5肉苁蓉多糖清除单线态氧1 O试验

单线态氧(1 O2)是Na ClO和H2 O2在37℃下发生化学反应产生的[5]。测定1 O2所用的溶液为100μL 2.8mmol/L Na ClO溶液,400μL 5 mmol/L NaO H溶液,300μL 10m mol/L H2 O2溶液,50μL1mmol/L Luminol溶液。反应时反应液加入到样品液中,化学发光仪同时自动记录反应进程。以NaClO-H2 O2-NaO H-Lumi nol为空白对照。启动反应,反应溶液从化学发光仪的贮液瓶中按程序设定的量加入到样品管中。随后反应混合物的化学发光强度每隔5s被记录在记录纸上,每一样品平行测3次,取其平均值。清除率按照下面的公式计算:清除率(%)=(对照发光强度-样品发光强度)/对照发光强度×100%。

参考文献

[ 1 ] 凌关庭 .抗氧化食品与健康 [ M ] .北京: 化学工业出版社 , 2004. 1— 58.

[ 2 ] 高明,田子玉 ,蔡红梅等. 肉苁蓉多糖的碱提取及其化学分析 [ J] . 农产食品科技 , 2008, 2( 3): 32— 34.

[ 3 ] 石双群 ,宋新芳 .多巴胺的自氧化作用 [ J]. 河北师范大学学报 , 1997, 21( 4): 387— 389.